随着北伐战争的节节胜利，尤其是上海、南京的相继克复，蒋介石的反共面目越来越暴露出来。1927年3月，蒋介石开始加紧勾结中外反动势力，积极策划反革命政变。4月1日，从德国经苏俄回国的汪精卫抵达上海，汪的回国使得国民党内部展开了新一轮的权力角逐。如何处理这种复杂的内部矛盾和外部矛盾，如何对付同盟者的背叛和突然袭击，已经成为迫切的任务。对于缺乏经验的共产党人来说，这的确是一个很大的难题。

早在1926年年底的中共中央汉口特别会议上，就通过了《关于国民党左派问题议决案》，规定应从各个方面帮助国民党左派，使之形成一个强大的政治力量，以同右派势力的反动倾向作斗争，从而“减少国民政府之军事独裁的性质。”这个决议认为，国民党左派虽然软弱动摇，仍应该团结他们、支持他们，是对的;但是决议实际上是把同右派斗争的希望全部寄托在国民党左派身上，特别是对即将回国的汪精卫寄托了挽救危机的全部希望。

陈独秀根据共产国际的指示，反对中共包办国民党的错误，要求中共各地党组织帮助汪精卫发展党派势力，使他们“有群众、有力量”。他赞成国民党左派提出的以农民为国民党的阶级基础的观点，要求中共帮助汪精卫等国民党左派上层领袖争取农民和城市小资产阶级群众。为了争得蒋介石同意汪精卫回国，中共中央曾先后三次派张国焘等人去见蒋介石，多次请苏联军事顾问加伦劝说蒋介石同意汪精卫回国。陈独秀向蒋介石的代表提出了三点保证：“一是蒋汪合作，不是迎汪倒蒋;二是仍维持蒋之军事首领地位，愈加充实扩大蒋之势力作更远大之发展，决不主张别的军人拥汪倒蒋;三是不主张推翻整理党务案。”几乎同时，中共中央还决定，“必须使蒋扩充至10个师以上的力量，以备应付未来与奉系的斗争，使他抛弃目前和汪的争持”。对于与蒋有矛盾的唐生智，陈独秀是一面争取唐支持迎汪回国，一方面又帮助他发展实力。陈独秀在蒋、汪、唐之间搞平衡，一再体现其相互制衡、相互牵制的策略。目的是为防止、打破蒋介石的军事独裁，维持统一战线，共同对付帝国主义和北洋军阀。

1927年4月3日，汪精卫与蒋介石单独进行会谈，汪精卫既担心共产党，又不满蒋介石。4月4日，陈独秀与汪精卫在上海举行会谈。4月5日，陈独秀征得汪精卫的同意，将会谈结果写成《汪精卫、陈独秀联合宣言》发表。这个宣言认为，“国民党领袖将驱逐共产党，将压迫工会与工人纠察队”等，都是“谣言”。宣言希望国共两党党员“立即抛弃相互间的怀疑，不听信任何谣言，相互尊敬，事事开诚协商进行”。然而，《汪精卫、陈独秀联合宣言》并未在实质上使局势有所缓和，反而掩盖了蒋介石发动反革命政变的阴谋，麻痹了部分党员和革命群众，客观上促成了四一二反革命政变的到来。

蒋介石已决心在上海发动政变以叛变国民革命，1927年4月12日凌晨，大批早就作好准备的青红帮武装流氓冒充工人，从租界冲出，向分驻上海总工会等处的工人纠察队发动突然袭击，工人纠察队奋起抵抗。双方正在激战，第二十六军开来，声称要调解“工人内讧”。工人纠察队员看到前来的军队将武装流氓的枪械收缴，满心欢迎这批调解者的到来;结果，在毫无戒备的情况下，被强行缴械。一部分纠察队员察觉到“调解者”的真面目，进行英勇抵抗，但因众寡悬殊，遭到悲壮的失败。在此前一日，上海总工会委员长汪寿华已被秘密扣留，随即惨遭杀害。事变发生后，上海工人及各界群众发动总罢工和游行示威，表示强烈抗议。4月13日上午，上海总工会在闸北青云路广场举行有10万工人参加的群众大会，会后整队游行，要求释放被捕工友，交还纠察队枪械。游行队伍行至宝山路时，埋伏在里弄内的第二十六军士兵突然冲出，用步枪、机关枪向密集的游行群众扫射，打死100多人。此后，疯狂的搜捕和屠杀继续进行。到4月15日，上海工人300多人被杀，500多人被捕，5 000多人失踪。这就是震惊中外的四一二反革命政变。

四一二反革命政变造成了国民革命联合战线内部的巨大变动和分化，是国民大革命从高潮走向失败的转折点。